新型混菌发酵制备丙酸工艺及其优化

以产酸丙酸杆菌和酵母菌为菌种,进行混菌发酵制备丙酸的工艺研究,并探索最优工艺条件.通过单因素实验和正交优化实验确定了最优发酵工艺条件为:酿酒酵母为辅助菌,接种比例为Pa∶Sc=2.5∶1,接种间隔时间为8h,发酵温度为30℃,以NaOH(2mol/L)溶液为中和剂,采用自动流加方式,发酵时间为180h.优化后的混菌发酵工艺能有效提高丙酸产量,丙酸产量达24.16g/L,与纯菌发酵相比提高46.34％.
采用Alcalase蛋白酶酶解大豆蛋白,通过测定酶解产物的蛋白质回收率、水解度、隆丁(Lundin)区分以及SDS-PAGE电泳图谱分析,确定在酶解条件为酶解温度55℃、底物质量分数5％、酶量750 U/g、pH 8.0、反应时间0.5～1.0 h时所得的酶解液为浅棕色,其Lundin分布较为接近麦汁Lundin区分分布的要求,蛋白质回收率约65％,可与啤酒糖浆复配作为啤酒发酵的氮源.
糖蛋白(Glycoprotein,G)作为鲤春病毒血症病毒(Spring Virernia of Carp Virus,SVCV)主要的抗原蛋白,已成为现阶段SVCV病毒检测、抗体制备以及疫苗研制的热点.为了对其进行酵母表面展示,研究以SVCV-shlj1分离株基因组为模板,通过RT-PCR技术,体外扩增获得SVCV表面糖蛋白的基因开放阅读框(1530 bp)片段,将其克隆至酵母表面展示载体pYD1,构建重组质粒pYD1-G.利用电转化方法将重组质粒pYD1-G导入酿酒酵母EBY100感受态细胞,经YNB选择培养基筛选和菌液PCR的鉴定,挑选出阳性转化子(命名为EBY100-pYD1-G),对其进行2％半乳糖诱导.利用细胞免疫荧光和流式细胞仪检测G蛋白的酵母表面展示情况.细胞免疫荧光结果显示,诱导后的酵母细胞EBY100-pYD1-G能产生特异性红色荧光,且随着诱导时间的增加,红色荧光的酵母细胞所占比例不断增加,各组之间差异显著(P<0.05).流式细胞仪检测结果显示,酵母细胞的荧光强度与诱导时间呈正比,其中诱导48h与72h的酵母细胞荧光强度不存在显著差异,基本趋于稳定不变的状态.因此,选取诱导48h为酵母表面展示的最佳诱导时间.上述研究结果表明SVCV的G蛋白已经成功展示于酿酒酵母细胞表面,研究为鲤春病毒血症酵母口服疫苗的研发奠定了前期基础.
介绍谷氨酰转肽酶(γ-GT)的研究概况,重点综述酿酒酵母中谷氨酰转肽酶的结构以及催化机制.酿酒酵母γ-GT在细胞中与谷胱甘肽水甲的高低有密切关系,并在酵母细胞解毒或抗外界胁迫及液泡氨基酸转运的过程起着重要作用.目前,γ-GT在临床医学和工农业中有着重要的地位,并对细胞内解毒重要物质--谷胱甘肽的含量有着重要的影响.
为解决葡萄酒专用乳酸菌依赖国外进口,导致葡萄酒品质同质化严重的问题,以甘肃河西走廊产区处于自然苹果酸-乳酸发酵(苹乳发酵)的葡萄酒为来源,筛选具有本土特色的优势乳酸菌.通过改良MRS培养基分离乳酸菌,经生理生化、16S rDNA基因同源性分析等鉴定,并对筛选菌株进行酿酒特性分析.获得3株具有启动苹乳发酵的小片球菌(Pediococcus parvulus,P.parvulus)且均具有较强的降酸能力,较商品乳酸菌差异不显著,其中菌株C30在低温(15℃)、高乙醇体积分数(14％)和高SO2质量浓度(50 mg/L)条件下的生物量显著高于商品乳酸菌.菌株C30可作为启动苹乳发酵的优势菌株,对提升河西走廊产区葡萄酒品质具有一定的应用潜力,在一定程度上推动葡萄酒品质同质化问题的解决.
构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2, 克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec. 该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.